بافرهای محلول سازی در الکتروفورز 2 بعدی (عوامل احیاء کننده)
عوامل احیاء کننده
عوامل احیاء کننده گروه تیول برای شکستن پیوندهای دی سولفیدی داخل و بین مولکولی مورد استفاده قرار می گیرند . معمولا این مرحله از اهمیت زیادی در محلول سازی برخوردار است . به خصوص برای پروتئین های منفک شده از سلولهای اوکاریوتی که نحوه تاخوردگی آنها بر پایه پیوند های دی سولفیدی استوار است .
مرکاپتواتانول در روشهای ابتدایی الکتروفورز 2 بعدی به کار گرفته می شد . اما به خاطر مشکلاتی که داشت امروزه از آن استفاده نمی شود . در واقع قسمتی از مرکاپتواتانول در PH بازی یونیزه می شود و داخل قسمت بازی ژل IEF می گردد و به خاطر قدرت بافر کنندگی موجب تخریب شیب PH در قسمت بازی می شود . اگر چه دی تیو تریتول (DTT) دارای pKa حدود 8 است ، اما به دلیل اینکه در غلظت بسیار کمتری استفاده می شود ، ( معمولا 50mM در مقایسه با 700mM موجود در 5% مرکاپتواتانول ) ، ایجاد مشکل مرکاپتواتانول را نمی کند .
دی تایوترایتول DTT و دی تایو اریتریتول DTE ، (Dithioerythritol) رایجترین عوامل احیا کننده مورد استفاده در محلول سازی پروتئین ها و IEF هستند . این معرف ها در یک واکنش تعادلی اکسیده شده و در عوض باعث احیاء پیوندهای دی سولفیدی می شوند . به همین دلیل معرفهای احیاء کننده در مقادیر اضافی ( حداکثر تا 100 میلی مولار ) مورد استفاده قرار می گیرند .
ساختمان شیمیایی DTE و DTT و واکنش آنها با پروتئین ها
به هر حال معرفهایی نظیر DTT و DTE کمی اسیدی و دارای بار الکتریکی هستند ، به همین دلیل در حین الکتروفوکوسینگ به سمت آند مهاجرت می کنند که این امر می تواند منجر به اکسیداسیون مجدد پروتئین های نمونه ، از دست دادن حلالیت نمونه در حین الکتروفورز و ایجاد رگه های افقی در قسمت بازی ژل شود . مخصوصا زمانی که از شیبهای IPG بازی بر روی بعد اول استفاده می شود . این پدیده مشهود تر است . این مسئله را می توان با قرار دادن یک کاغذ الکترود اضافی که در 20 میلی مولار DTT خیسانده شده است . بر روی کاتد حل کرد . بدین ترتیب جایگزینی DTT داخل ژل که به سمت آند حرکت می کند با DTT که این کاغذ در کاتد آزاد می گردد ، تضمین خواهد شد . روش دیگر برای اجتناب از وقوع این پدیده و حفظ قدرت تفکیک ، عدم انجام فوکوسینگ در زمانهای طولانی است .
فسفاین ها (Phsphines) می توانند جایگزین معرفهای احیاء کننده تیول باشند . معرف احیاء کننده بدون بار الکتریکی نظیر تری بوتیل فسفین Tributhyl phosphine , TBP در تمام طول IEF شرایط احیا را حفظ می کند . بدین ترتیب از ایجاد توده های پروتئینی ناشی از ایجاد مجدد پیوندهای دی سولفیدی ممانعت می نماید . علاوه بر این مزیت دیگر TBP امکان استفاده از آن در IEF با شیب های PH بازی است ، چرا که در این شیبها نیز شرایط احیا کنندگی را حفظ می نمایند . از خصوصیات دیگر فسفین ها عدم واکنش دهی شان با برخی از عوامل آلکیله کننده نظیر آکریل آمید و 4- وینیل پیریدین است . در زمان متعادل سازی می توان از این خاصیت برای طراحی یک مرحله ای احیا و آلکیلاسیون با TBP و آکریل آمید استفاده کرد . باید به این نکته توجه کرد که اسیدهای آیودو استیل و آمین ها با فسفینها واکنش می دهند و اگر در آلکیلاسیون از این مواد استفاده شود باید مراحل احیا و الکیلاسیون به صورت جداگانه صورت پذیرند .
فسفاین ها با زنجیره کوتاه مثل TBP در غلظتهای استوک ، موادی فرار ، سمی ، و به شدت قابل اشتعال هستند . اگر چه استوک های رقیق شده را می توان با امنیت مناسب مورد استفاده قرار داد ، اما مشکل در حمل و نقل استوکهای غلیظ است . در عین حال قیمت TBP در مقایسه با DTT بسیار بیشتر است .
پذیرش مقالات ,آموزش , مشاوره و شرکت در طرحهای تحقیقاتی و تولیدی و پایان نامه های دانشجویی در رابطه با تخلیص پروتئین ها با روشهایی مثل الکتروفورز کروماتوگرافی و غیره (وابسته به مؤسسه تحقیقات واکسن وسرم سازی رازی ، کرج)
روز بخير كاربر مهمان! 
